如何操作竞争elisa法
来源:    发布时间: 2018-01-02 15:23   100 次浏览   大小:  16px  14px  12px
           

                              如何操作竞争elisa法

ELISA是一种免疫测定。免疫测定(immunoassay,IA)是应用免疫学技术测定标本的方法。在临床检验中主要通过抗原抗体反应检测体液中的抗体或抗原性物质。
今天,小编为大家介绍elisa竞争法的实验操作方法。
工具/原料
elisa试剂盒(Elabscience,E-EL-0065c)
酶标仪(450nm波长滤光片)
高精度移液器,EP管及一次性吸头:0.5-10μL, 2-20μL, 20-200μL, 200-1000μL
37℃恒温箱,双蒸水或去离子水
吸水纸
样品收集
1.        血清:全血样品于室温放置2小时或4℃过夜后于1000×g离心20分钟,取上清即可检测,收集血液的试管应为一次性的无热原,无内毒素试管。
2.        血浆:抗凝剂推荐使用EDTA-Na2,样品采集后30分钟内于1000×g离心15分钟,取上清即可检测。避免使用溶血,高血脂样品。
3.        组织匀浆:用预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组织,去除残留血液(匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果),称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS(一般按1:9的重量体积比,比如1g的组织样品对应9mL的PBS,具体体积可根据实验需要适当调整,并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂)加入玻璃匀浆器中,于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞,可以对匀浆液进行超声破碎,或反复冻融。最后将匀浆液于5000×g离心5-10分钟,取上清检测。
4.        细胞培养上清:取细胞培养上清于1000×g离心20分钟,除去杂质及细胞碎片。取上清检测。
5.        其它生物样品:1000×g离心20分钟,取上清即可检测。
6.        样品应清澈透明,悬浮物应离心去除。
7.        样品收集后若在1周内进行检测的可保存于4℃,若不能及时检测,请按一次使用量分装,冻存于-20℃(1个月内检测),或-80℃(6个月内检测),避免反复冻融。
8.        如果您的样品中检测物浓度高于标准品最高值,请根据实际情况,做适当倍数稀释(建议先做预实验,以确定稀释倍数)。
检测前准备工作
1.          请提前20分钟从冰箱中取出试剂盒,平衡至室温。
2.          将浓缩洗涤液用双蒸水稀释(1:25)。未用完的放回4℃。从冰箱中取出的浓缩洗涤液可能有结晶,属于正常现象,可用40℃水浴微加热使结晶完全溶解后再配制洗涤液(加热温度不要超过50℃,使用时洗涤液应为室温)。当日使用。
3.          标准品: 于10000×g离心1分钟,加入标准品&样品稀释液1.0mL至冻干标准品中,旋紧管盖,静置10分钟,上下颠倒数次,待其充分溶解后,用移液器将其轻轻混匀(浓度为1000pg/mL)。然后根据需要进行倍比稀释(注:不要直接在反应孔中进行倍比稀释)。建议配制成以下浓度:1000、500、250、125、62.5、31.25、15.63、0pg/mL,样品稀释液直接作为空白孔0pg/mL。如配制500pg/mL标准品:取0.5mL1000pg/mL的上述标准品加入含有0.5mL样品稀释液的EP管中,混匀即可,其余浓度依此类推。
洗涤方法:
1.          自动洗板机:每孔加入洗涤液350μL,注入与吸出间隔60秒。
2.          手工洗板:甩尽孔内液体,在洁净的吸水纸上拍干,每孔加洗涤液350μL,浸泡1-2分钟,吸去(不可触及板壁)或甩掉酶标板内的液体,在厚的吸水纸上拍干。
操作步骤:
加样。弃去孔内液体,甩干,洗板3次,每次浸泡1-2分钟,大约350μL /每孔,甩干并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干。
2
每孔加酶结合物工作液(临用前15分钟内配制)100μL,加上覆膜,37℃温育30分钟。弃去孔内液体,甩干,洗板5次,
3
每孔加底物溶液(TMB)90μL,酶标板加上覆膜37℃避光孵育15分钟左右(根据实际显色情况酌情缩短或延长,但不可超过30分钟。当标准孔出现明显梯度时,即可终止)。
4
每孔加终止液50μL,终止反应,此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度(OD值)。应提前打开酶标仪电源,预热仪器,设置好检测程序。
注意事项
酶标板:刚开启的酶标板孔中可能会有少许水样物质,此为正常现象, 不会对实验结果造成任何影响。暂时不用的板条应拆卸后放入备用铝箔袋,按推荐温度存放!
试验中请穿着实验服并带乳胶手套做好防护工作。特别是检测血液或者其他体液样品时,请按国家生物试验室安全防护条例执行。