病毒TCID50测定(组织半数感染量)方法
来源:    发布时间: 2018-01-23 15:04   103 次浏览   大小:  16px  14px  12px
病毒TCID50测

病毒TCID50测定(组织半数感染量)方法

实验步骤

1. 准备细胞
取出一块细胞培养板,每个孔大约传8000~10000个细胞(一个T25瓶的细胞消化后加10ml培养液正好传一块96孔板,要传匀)。每个孔的细胞铺成单层大约60%丰度即可接种病毒(下午传好板第二天早上就能用)。
细胞对照选取16个孔即可。滴定与对照可以在一块培养板上进行,操作中注意不要窜孔。也可以分别在不同的细胞培养板上进行,但要保证实验条件一致。
2. 稀释待测病毒液。
A法为参考书上标准的操作方法
B法参照书将液体量减少后的结果
病毒稀释液根据是否需要胰酶来选择适合的液体,无论哪种都无血清。
   A向每支试管中加入1.8ml病毒稀释液。向1号试管中加入0.2ml病毒,依次10倍系列稀释至适宜浓度,最后一支试管。
   B在EP管中用无血清的孵育液10倍倍比稀释病毒原液(10-1,10-2…10-10等),根据病毒大致的滴度确定稀释的倍数。首次滴定可以多稀释几个滴度。
根据接种的孔数稀释病毒,常规每个稀释度接种4孔,则每个稀释度配500µl,即10-1为50µl加入450µl的孵育液中;如每个稀释度接种8个孔,则各配制1ml,即10-1为100µl加入900µl孵育液中。若接种8个孔,则相应增加液体量。上述的配液并不是固定不变的,可以根据接种的量自行调整。
此步操作注意事项:
   1)建议每个稀释度接种8个孔,若要统计分析则还要增加至16个孔。
   2)病毒稀释过程中一定将病毒液与孵育液充分混匀。
 此过程中需要使用加样器和tip头。使用前用75%乙醇擦拭加样器,并用紫外线照射20min,确保无菌。使用新高压的tip头,外包装一定在超净台(或安全柜中打开)。
3. 接种
取细胞培养板,用多道加样器(又称排枪)吸去96孔板中的培养液,吸取孵育液加在每孔中再轻轻吹打一次,然后吸出孵育液(此步目的是去除血清,因为血清能干扰病毒的吸附)。将稀释好的病毒液加到96孔板上,每孔100µl,根据观察的习惯,一般从右到左,从上到下,从高稀释度到低稀释度(10-1,10-2 )到原液加样。(切记:设置正常的细胞对照。每次实验要重复4次,计算标准差。)
37℃CO2培养箱中孵育1h,取出培养板吸去病毒液(从低浓度向高浓度吸取可避免窜孔),加入维持液200µl继续在37℃ CO2培养箱中培养。
4. 培养
将培养板放置于CO2培养箱。培养温度,培养2天。
5. 测定结果
取出培养板,显微镜下观察细胞病变。

计算方法
   1) Spearman-Karber 法
   2) Reed-Muench法
观察CPE,找出能引起半数细胞瓶或管感染的病毒稀释倍数,按计算出该病毒液的TCID50。